高通量測序 鎖定病原體“命門(mén)”
病原體能使人類(lèi)群體性致病甚至致死，為追本溯源，找到變異基因作為有效靶點(diǎn)，科學(xué)家們在迎戰埃博拉病毒的過(guò)程中取得突破。
《科學(xué)》雜志的歷史上，刊載過(guò)一篇沉重的學(xué)術(shù)文章。2014年一篇關(guān)于通過(guò)基因組學(xué)手段監測埃博拉病毒的起源和傳播的論文，在刊登時(shí)已有6名研究人員因感染埃博拉而死亡。
“對埃博拉病毒的研究和控制是高通量測序技術(shù)(二代測序技術(shù))全面應用的首次‘實(shí)戰’。”日前，在由中國醫學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫學(xué)院主辦的第二屆感染性疾病精準醫學(xué)高峰論壇上，參加過(guò)與埃博拉病毒一線(xiàn)作戰的研究人員，對中國團隊與埃博拉病毒“作戰”的戰略戰術(shù)進(jìn)行了揭秘。中國科學(xué)院武漢病毒研究所研究員劉翟表示，病原體能使人類(lèi)群體性致病甚至致死，二代測序技術(shù)及宏基因組學(xué)能幫助人類(lèi)追溯病原體、捕捉放大它們在分子水平上的變化、鎖定病原體“命門(mén)”，最終贏(yíng)得“人毒之戰”“人菌之戰”。
測準遺傳物質(zhì) 新策略抓住病毒“七寸”
在2014西非埃博拉病毒爆發(fā)期間，美國的團隊最初斷言病毒可能在加速進(jìn)化。劉翟回憶，這一發(fā)現在當時(shí)是一個(gè)“面臨強敵”的信號，它意味著(zhù)傳統的檢測防治方法或許失效，如果埃博拉病毒是迅速變化且致命性疊加的致病原，其危險性將比人類(lèi)最初認知的更高。
“病毒在短時(shí)間內迅速變化并不符合進(jìn)化邏輯。”劉翟說(shuō)，要改變美國團隊的結論，中國團隊需要提供更多的事實(shí)和數據。
中國團隊在非期間檢測了大量臨床樣本，對175株埃博拉病毒進(jìn)行了全基因組測序。“利用二代測序技術(shù)，很少的變異也能被‘覺(jué)察’到。”劉翟說(shuō)。
二代測序的應用不是簡(jiǎn)單地將病例樣本中的基因提取出來(lái)進(jìn)行比對。全基因組的遺傳信息繁雜而海量，測定不只包括量的疊加，還包括相互作用和影響，即測定病毒在宿主體內的進(jìn)化，以體現宿主和病毒的基因組之間的相互作用與關(guān)聯(lián)。宏基因組學(xué)的研究基礎是人和病毒的遺傳物質(zhì)混在“一個(gè)籃子里”，這增加了研究工作難度;此外，由于埃博拉病毒是RNA病毒，共同提取的將是人類(lèi)遺傳物質(zhì)中的RNA，RNA的復雜程度也加大了研究難度……
為此，研究團隊設計開(kāi)發(fā)了埃博拉病毒基因組的新測序策略——擴增子深度測序技術(shù)，并開(kāi)發(fā)了一套全新的生物信息學(xué)分析流程。“我們設計了標準質(zhì)粒進(jìn)行方法驗證，將測序方法的假陽(yáng)性率控制在千分之一以下。”劉翟介紹，考慮到在宿主中病毒的痕量，團隊還在方法的敏感性上取得了突破，做到低濃度樣本下仍能探測到位點(diǎn)變化。
團隊對于樣本的生物信息學(xué)分析，在病毒暴發(fā)過(guò)程中第一次鎖定了埃博拉病毒的“進(jìn)攻線(xiàn)路圖”。劉翟展示的病毒地理學(xué)聯(lián)絡(luò )圖，顯示與西非的城市熱度和交通樞紐相一致。
除了進(jìn)攻路線(xiàn)，團隊還揭示了埃博拉病毒基于自身的“戰術(shù)變化”——在宿主內，埃博拉病毒曾經(jīng)產(chǎn)生了710個(gè)單核苷酸變異位點(diǎn)，也維持著(zhù)最保守基因的不變。保守基因的發(fā)現相當于抓到了病毒的“七寸”。劉翟逆向思維，“最保守基因的突變對于病毒大都有害，可以作為最有效的抗病毒靶點(diǎn)。”
預判威脅 防患SARS“東山再起”
同類(lèi)技術(shù)在SARS(嚴重急性呼吸綜合征)同族病毒的發(fā)現與監控中，也發(fā)揮了居功至偉的作用。
幾年前，廣東省四個(gè)豬場(chǎng)出現了小豬仔急性腹瀉死亡的疫情，兩萬(wàn)多頭小豬出生后6天之內迅速死亡。這引起了軍事醫學(xué)科學(xué)院研究員童貽剛的注意，“近年來(lái)發(fā)生的重大傳染病疫情大部分由動(dòng)物病毒跨種傳播引起，此次疫情發(fā)生地距離SARS發(fā)源地小于100公里。我們通過(guò)遺傳物質(zhì)的測序確定致病病毒也是一類(lèi)冠狀病毒。”病毒類(lèi)型、發(fā)生地點(diǎn)以及近年規律都不同程度地亮起“警報”。
《變形金剛》里的威震天被消滅多次，卻會(huì )在宇宙的盡頭休整，一旦人們放松就伺機重生。SARS冠狀病毒在2003年造成了全球性的恐慌之后，會(huì )不會(huì )上演威震天的戲碼?
為了回答新發(fā)現病毒與SARS病毒同源性如何、如何傳播、感染人類(lèi)能力等問(wèn)題，多個(gè)科研機構組成的團隊共同展開(kāi)研究，基于二代測序技術(shù)進(jìn)行病毒分離鑒定、動(dòng)物感染回歸實(shí)驗、回顧性檢測等工作。團隊將新病毒命名為豬急性腹瀉綜合征(SADS)冠狀病毒。
“通過(guò)新舊病毒的比對，我們發(fā)現它與SARS病毒在外殼蛋白上有86%的相似度。”童貽剛說(shuō)，這說(shuō)明感染蛋白可能發(fā)生了變化。也就是說(shuō)，病毒獲準進(jìn)入機體完成感染的“敲門(mén)磚”變了。
隨后，科研團隊用已確定的病毒特征為“釣餌”，在廣東地區近幾年收集的蝙蝠標本中，尋找是否有蝙蝠攜帶關(guān)聯(lián)病毒。在幾百個(gè)樣本中，團隊獲得了58份結果為陽(yáng)性的樣本，大部分來(lái)自中華菊頭蝠(注：科學(xué)家們此前證實(shí)SARS病毒正是來(lái)源于中華菊頭蝠)。團隊進(jìn)行了病毒傳播路線(xiàn)圖的繪制，發(fā)現發(fā)病的4個(gè)豬場(chǎng)并沒(méi)有相互傳染，很有可能是通過(guò)蝙蝠的糞便傳播。
“我們對豬場(chǎng)的飼養員進(jìn)行了病原體檢測，沒(méi)有發(fā)現人員感染。”童貽剛說(shuō)，但是對于病毒組學(xué)的研究表明，該類(lèi)病毒是有能力感染人類(lèi)的。病毒對人體的作用，以及激發(fā)人體內的免疫反應和對病毒表達的調控，仍是一個(gè)嚴峻課題，有待探索。
初入臨床 顛覆對罕見(jiàn)菌致病性認識
除了在威脅全球的重大傳染病疫情的防控中發(fā)揮重要作用，二代測序技術(shù)在日常臨床中的應用將有助于“認新”“控藥”“測毒”等，即診斷新型病原體、確定病毒的抗藥性以防止抗生素濫用、測定不同流行病的源頭等。
“近一年僅我們團隊在診斷病歷中就發(fā)現8例諾卡氏菌病例。而在教科書(shū)中，這類(lèi)菌被描述為罕見(jiàn)菌。”復旦大學(xué)附屬中山醫院感染病科主任胡必杰教授說(shuō)，過(guò)往資料表明，人類(lèi)對這種菌的致病性認識非常有限。
胡必杰認為，現實(shí)與教科書(shū)中的反差是由于此前的手段難以幫助醫生診斷出這種致病菌。“它非常細小，在同樣的培養條件下，很難被分離出來(lái)，而且需要7天才會(huì )培養到可見(jiàn)。普通培養一般3天。”胡必杰說(shuō)，菌體的“個(gè)性”使得憑經(jīng)驗在病例中發(fā)現它相對困難。
二代測序技術(shù)讓它們重新回到醫生的診斷“視野”。胡必杰表示，通過(guò)對宏基因組進(jìn)行測序，可無(wú)差別地檢測各種病原體，突破了傳統檢測手段的限制，大大提高了病原學(xué)檢出的敏感性，這種之前難以被檢出的病原體也“露了餡”。24小時(shí)內診斷也能為急性感染的判斷和對癥迅速給出參考。
由于設備要求高、技術(shù)門(mén)檻高、平臺構建需要大量資金投入，目前在臨床應用領(lǐng)域，二代測序只是“初入”，只有條件好、資金充足的少量三甲醫院在建相關(guān)平臺、培養和儲備技術(shù)人員。此外，不同樣本的提取如何才能高效準確、遺傳物質(zhì)的提取質(zhì)量標準如何，都尚待完善。中國食品藥品檢定研究院的雙盲測試表明，對于同樣的已知基因，不同測序公司的結果也并非完全一致。
中國工程院副院長(cháng)、中國醫學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫學(xué)院院校長(cháng)王辰院士呼吁：感染性(傳染性)疾病危害嚴重，精準診斷是實(shí)現其精準防控的前提。針對感染這一重大醫學(xué)問(wèn)題，需要將基因檢測與傳統檢測相結合，加快將最新的生物科技轉化成先進(jìn)生產(chǎn)力，應用于臨床感染精準診療。(記者 張佳星)
